Bactéries: une nouvelle source pour dissuader les moustiques de s'alimenter

Bactéries: une nouvelle source pour dissuader les moustiques de s'alimenter

RésuméLes bioactivités antibiotiques et insecticides des métabolites secondaires extracellulaires produits par des bactéries entomopathogènes appartenant au genre Xenorhabdus ont été identifiées; Cependant, leurs nouvelles applications telles que la dissuasion alimentaire des moustiques n'ont pas été rapportées. Nous montrons ici qu'un mélange de composés isolés de cultures in vitro de Xenorhabdus budapestensis présente une puissante activité d'alimentation dissuasive contre trois vecteurs de moustiques mortels: Aedes aegypti, Anopheles gambiae et Culex pipiens. Nous démontrons que la fraction active dissuasive isolée à partir de cultures bactériennes répliquées est fortement enrichie en deux composés compatibles avec les fabclavines décrites précédemment, suggérant fortement qu'il s'agit de l'espèce moléculaire responsable de la dissuasion alimentaire. L'activité dissuasive des moustiques dans la fraction présumée riche en fabclavine est comparable ou meilleure que celle du N, N-diéthyl-3-méthylbenzamide (également connu sous le nom de DEET) ou de la picaridine dans des dosages côte à côte. Ces résultats jettent les bases de la recherche sur des composés de faible poids moléculaire, à base de peptides et biologiquement dérivés, isolés à partir de bactéries et destinés à être exploités comme répulsifs contre les moustiques et comme moyens de dissuasion.INTRODUCTIONS Les métabolites secondaires ou spécialisés (1) constituent un groupe chimiquement diversifié de composés organiques produits par certains microbes, plantes et animaux (2). Généralement considérés comme non essentiels à la croissance et au développement, les métabolites secondaires jouent d'autres rôles, tels que la protection contre les risques environnementaux variés. De nombreux métabolites secondaires d'origine microbienne ou végétale ont été exploités pour une multitude d'applications dans l'industrie pharmaceutique, notamment les antibiotiques, les médicaments chimiothérapeutiques, les immunosuppresseurs et d'autres médicaments (2). Les métabolites secondaires produits par Xenorhabdus, un groupe de bactéries qui s'associent symbiotiquement avec les nématodes entomopathogènes, présentent une gamme d'activités antibiotiques, antifongiques et insecticides (3–9). Des études sur le génome (6, 10) suggèrent qu'il existe une gamme énorme de substances chimiques. diversité et la bioactivité qui restent à explorer et pourraient conduire à la découverte de nouveaux composés bioactifs. À Xenorhabdus, l’exploitation du génome a permis de découvrir des grappes de gènes susceptibles de participer à la synthèse de plusieurs composés de fonctions biologiques inconnues (11). Les produits codés par ces groupes de gènes présentent des chimies diverses et structurellement complexes. Un exemple produit par Xenorhabdus budapestensis (Xbu) est une classe unique de composés hybrides appelés fabclavines. Il a été démontré que ces composés présentaient une large gamme de bioactivités, notamment des activités antibiotiques et insecticides (3, 4, 11, 12). De manière unique, les surnageants de culture de deux bactéries destructrices d’insectes, Xenorhabdus nematophila et Photorhabdus luminescens, ont également découragé l’alimentation des fourmis, des grillons et des guêpes (13, 14). Cependant, les composés bioactifs responsables de la dissuasion alimentaire dans ces études n'ont pas été identifiés. Ensemble, ces études suggèrent que les métabolites secondaires produits par Xenorhabdus pourraient jouer un rôle dissuasif pour l'alimentation des moustiques. Les agents de réticulation (topiques et locaux) peuvent protéger des morsures de moustiques (et d'autres insectes qui se nourrissent de sang) et, partant, des agents pathogènes qu'ils transmettent lors de l'alimentation. (15, 16). Les moustiques transmettent des agents pathogènes qui causent des maladies humaines dévastatrices, notamment la dengue, le chikungunya, le virus du Nil occidental et le virus Zika, qui continuent de toucher des millions de personnes dans le monde. Limiter l'impact des maladies transmises par les moustiques est un objectif important des agences mondiales de santé publique, et l'utilisation de répulsifs contre les moustiques est une tactique importante. Parmi les insectifuges topiques homologués par la US Environmental Protection Agency des États-Unis, une majorité de plus de 500 produits contient l'ingrédient actif N, N-diéthyl-3-méthylbenzamide (également connu sous le nom de DEET; www.epa.gov/insect-repellents/skin-applied anti-répulsifs), qui est le répulsif le plus largement utilisé et le plus efficace contre les moustiques et les autres vecteurs de maladies. Parmi les autres répulsifs contre les insectes (17) qui ont connu un succès commercial, citons le IR3535 (insectifuge 3535, l’éthyl butylacétylaminoproprionate (EBAAP), un dérivé de la β-alanine (18)), (p) l’icaridine (et d’autres dérivés de la pipéridine) (19), et le para-menthane -3,8-diol (distillé à partir d'Eucalyptus citriodora). Historiquement, la recherche sur les alternatives de DEET biologiquement dérivées s'est principalement concentrée sur les métabolites de plantes. Malgré l’exploitation de nombreux genres à des fins d’exploration pharmaceutique, les bactéries sont jusqu’à présent inexplorées dans la recherche de produits chimiques anti-insectes. Dans un criblage des activités répulsives produites par Xenorhabdus, nous avons observé que les extraits de Xbu dissuadaient les femelles adultes Aedes, Anopheles et Culex moustiques. alimentation sur un régime artificiel dans des expériences d'alimentation in vitro. Les composés présentant une activité dissuasive pour l'alimentation à partir de cultures bactériennes ont été concentrés via une procédure en trois étapes, y compris la chromatographie en phase inverse, et analysés par spectrométrie de masse (MS). Outre d'autres molécules, la fraction active dissuasive pour l'alimentation contenait systématiquement deux espèces moléculaires très abondantes que nous identifions provisoirement en tant que membres de la classe de molécules décrite précédemment, appelée fabclavines (11). Ici, nous présentons des données sur l’enrichissement et la caractérisation de l’activité dissuasive pour l’alimentation des moustiques produite par Xenorhabdus et apportons la preuve que les fabclavines peuvent être de puissants moyens dissuasifs pour l’alimentation des moustiques. Notre découverte ajoute que les bactéries constituent une source potentielle notable de nouvelles mesures dissuasives pour l'alimentation des moustiques et jettent les bases d'une exploration future de métabolites secondaires dérivés de bactéries comme moyens dissuasifs pour l'alimentation d'autres insectes nuisibles.RÉSULTATS ET DISCUSSIONLe système d'alimentation membranaire in vitro en tant que test de dépistage Activité dissuasive des moustiques dans les extraits de XbuDans le contexte des insectifuges, un dissuasif est défini comme «quelque chose qui empêche l'alimentation ou la ponte lorsqu'il est présent dans un endroit où l'insecte pourrait, en son absence, se nourrir, se reposer ou se déposer» (20). Ici, nous définissons les composés produits par Xbu comme dissuasifs pour l'alimentation des moustiques car, en présence de composés de Xbu, les moustiques femelles ne se nourrissaient pas de la source de nourriture décrite dans cette section. Parmi les méthodologies d'évaluation des dissuasifs / répulsifs contre les moustiques, les tests in vitro offrent des avantages importants. avantages En raison du risque associé à une exposition accidentelle à des agents infectieux lors d'essais standard au bras dans la cage (21, 22), et en raison de l'incohérence des résultats parmi les sujets du test en raison de l'attrait variable des moustiques pour l'homme (23), les chercheurs ont mis au point systèmes d'alimentation. Le sang est contenu dans une chambre de réchauffement et accessible aux moustiques femelles adultes à travers une membrane naturelle ou artificielle. Les doseurs à membrane fournissent des systèmes flexibles qui peuvent être modifiés en termes de solutions d’alimentation (24 à 26), de types de membranes (24, 25, 27) et de température de la solution (24, 25, 28). Ces systèmes éliminent le besoin d’exposer des animaux (29) ou des volontaires humains, ce qui est particulièrement important lorsque les composés en phase de sélection initiale ont des propriétés toxicologiques ou dermatologiques inconnues. Ainsi, nous avons choisi de modifier notre système d'alimentation à membrane Hemotek existant (Discovery Workshops, Accrington, Royaume-Uni) pour cribler les composés dissuasifs pour l'alimentation produits par la bactérie Xbu. Les principales caractéristiques de ce système (Fig. 1) comprenaient (i) une installation facile, (ii) un minimum d’espace de laboratoire, (iii) une source de température régulée par thermostat qui élimine le besoin d’un chauffe-eau et d’une pompe de circulation, et ) capacité de jusqu'à cinq tests de dépistage à la fois. Les modifications utilisées pour les essais biologiques finaux comprenaient l'introduction d'un tissu de coton tissé de manière lâche pour l'application des composés dissuasifs, une membrane de collagène et l'utilisation d'un régime cocktail contenant un colorant alimentaire rouge (24) au lieu de sang (27).
            
      
    Fig. 1 Description du système d'alimentation à membrane et de détection de dissuasion (A) Composants du système d'alimentation, y compris (panneau supérieur / inférieur, de gauche à droite) Régulateur de température Hemotek, assemblage chargeur-logement, alimentateur en métal assemblé avec régime cocktail (couleur rouge) fixé avec une enveloppe en collagène et un joint torique, deux couches de tissu en coton, un chargeur en métal avec un tissu en coton fixé via des bandes de caoutchouc (non visibles) et un système d’alimentation en métal fixé au boîtier du système. ID, diamètre intérieur. Crédit photo: Mayur Kumar Kajla, Université du Wisconsin – Madison. (B et C) Résultats des tests d'alimentation. (B) Une parcelle indiquant le nombre de moustiques A. aegypti nourris lorsque de l'eau a été appliquée sur le tissu en coton à titre de témoin, ou du DEET ou de la picaridine (0,95 mg / cm2) (équivalent à 1,0% (v / v)) a été appliquée sur trois reproduire des expériences. Chaque répétition consistait en 20 moustiques pour chaque contrôle ainsi que des tests. (C) Image représentative illustrant l'apparence des moustiques Aedes nourris (abdomens rouges) par rapport aux moustiques non nourris résultant du dosage biologique. Les images montrent des abdomens engorgés et du colorant rouge chez des moustiques nourris. L’absence de couleur et d’engorgement de l’abdomen indique qu’il n’ya pas eu d’alimentation avec du DEET à 1% (ou de la picaridine) comme contrôle positif. Nous avons d’abord testé ce système avec des contrôles positifs (DEET ou picaridine à 0,95 mg / cm2 dans l’eau; équivalents à 1,0% (v / v)) et négatifs (eau) appliqués sur le tissu recouvrant l’alimentateur à membrane. Les moustiques ont été autorisés à se nourrir pendant 30 min, puis congelés à -20 ° C avant de compter et de compter. Le succès de l'alimentation des moustiques a ensuite été noté en comptant les moustiques nourris et non nourris après des essais biologiques en présence ou en l'absence des composés répulsifs. Les résultats de l'analyse de dépistage sont illustrés à la Fig. 1 (B et C). En utilisant ce système, nous avons obtenu un succès reproductible et toujours élevé avec l'alimentation des moustiques lorsque le tissu en coton était traité avec de l'eau et une alimentation à 0% lorsque le DEET ou la picaridine ont été testés comme contrôles répulsifs positifs. Les résultats de trois expériences répétées (20 moustiques par répétition; le nombre total de moustiques testés dans trois expériences répétées = 60) sont présentés à la Fig. 1B et montrent un succès moyen en alimentation de 96,67%, avec des contrôles d'eau avec Aedes aegypti, Anopheles gambiae et Culex pipiens s'est également bien nourri (75 à 80%; figure 2), ce qui indique que l'essai biologique peut être utilisé avec plusieurs espèces de moustiques. Sur la base de ces résultats, nous avons déterminé que le test biologique fournissait un arène de test robuste et reproductible pour le criblage des activités dissuasives pour l'alimentation des moustiques dans les extraits de Xbu à différentes étapes de la purification.
            
      
    Fig. 2 Activité de dissuasion des moustiques du pic Xbu n ° 3 avec C. pipiens, A. gambiae et A. aegypti. (A) Les graphiques montrent l'activité de dissuasion des composés Xbu testés à 0,057 mg / cm2. Les données de trois expériences répliquées sont présentées. Chaque réplicat consistait en 20 moustiques pour chacun des témoins (eau uniquement) ainsi que des tests (Xbu Peak # 3), respectivement. Les moustiques A. aegypti ont été inclus à des fins de comparaison. (B) Apparition de moustiques Anopheles et Culex nourris (abdomens rouges) et non nourris. Dans cette expérience, une mousseline à une couche a été utilisée. Le test exact de Fisher a été utilisé pour évaluer les différences entre les groupes à l’aide du logiciel statistique Stata. De plus, cet essai biologique était optimal pour filtrer des quantités minimales de composés, une préoccupation majeure lorsque l'on travaille avec des composés microbiens produits naturellement, qu'il est difficile d'obtenir facilement en grandes quantités. La méthode a également fourni des résultats rapides ainsi que des mesures cohérentes de la dissuasion alimentaire reproductibles au fil des dates de dosage. Enrichissement et caractérisation des substances actives dissuasives pour l'alimentation des moustiques de XbuNext, nous avons développé une procédure permettant d'isoler les substances actives dissuasives de l'alimentation des moustiques à partir de cultures Xbu . Les bactéries Xenorhabdus sont connues pour produire des antibiotiques et des métabolites secondaires à la fin de la phase stationnaire de leur cycle de croissance (11, 30, 31). En conséquence, nous avons utilisé des cultures bactériennes de 72 heures pour récolter des composés dissuasifs pour l’alimentation des moustiques à partir des surnageants de culture sans cellules. Les composés actifs dissuasifs pour l'alimentation des moustiques dans les surnageants de culture ont été concentrés par précipitation à l'acétone. Au cours de l'étape suivante, les précipités d'acétone hydrosolubles ont donné un large pic détecté à 280 nm sur une colonne de chromatographie éclair en phase inverse C18, indiquant que les composés actifs dissuasifs pour l'alimentation des moustiques pouvaient être associés à d'autres composés détectables à 280 nm. L’activité d’alimentation dissuasive est concentrée et éluée sous la forme d’une fraction large et unique. Des images représentatives des résultats de purification au flash C18 sont illustrées à la fig. S1. La fraction de pic a été soumise à une analyse MS pour la détermination des masses moléculaires et la caractérisation structurelle. La désorption / ionisation au laser assistée par matrice (temps de vol) MS a révélé la présence de plusieurs espèces moléculaires abondantes, notamment des composés à m / z (rapport masse / charge) 1302,94, 1312,96 et 1430,07 dans cette fraction (Fig. 3A), avec des masses supplémentaires à m / z 44,03 unités plus élevées, ce qui laisse penser que ces masses étaient probablement liées. La différence de 44 unités de masse atomique est cohérente avec l’addition d’un fragment C2H4O (11).
            
      
    Figure 3: Spectre MALDI-TOF de la fraction de pointe active dissuasive pour l'alimentation des moustiques par Chromatographie en phase inverse C18 par chromatographie HPLC (A) L'analyse MALDI-TOF de la fraction active de dissuasion pour alimentation fractionnée instantanée C18 a donné plusieurs grandes masses espèces) à m / z 1302,94 (1346,97), 1312,96 (1356,98) et 1430,07 (1474,10), ainsi que m / z 1238,953. La différence de masse de m / z 44 dans ces paires peut être due à l'addition de fractions C2H4O (11). (B) L'analyse MALDI-TOF du pic Xbu actif n ° 3 actif en tant qu'élément dissuasif et séparé pour la HPLC montre l'enrichissement des deux mêmes espèces moléculaires abondantes (et apparentées) à m / z 1302,92 et 1346,95. La fraction active dissuasive pour l'alimentation des moustiques issue de la chromatographie éclair C18 a été soumise à une seconde étape de fractionnement en utilisant la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) analytique après une étape d'ultrafiltration (voir Matériels et méthodes pour plus de détails). Quatre pics majeurs ont été observés, la majeure partie de l'activité répulsive étant concentrée dans le pic numéro 3 (désigné ci-après par Xbu Peak # 3), qui s'est élué à environ 24% d'acétonitrile (ACN). Des images représentatives de la purification par CLHP C18 sont présentées à la fig. S2. Aucun des autres pics n'a montré d'activité dissuasive (fig. S3, A et B) sauf le pic 4. L'activité du pic 4 est probablement due à la contamination croisée du pic 3 résultant de la résolution incomplète de ces pics. L'analyse MS du pic Xbu n ° 3 a montré deux masses très abondantes à m / z 1302.9 et 1346.9 (Fig. 3B), indiquant que ces composés, précédemment observés dans la fraction active de la chromatographie éclair en C18, avaient été enrichis en dissuasif pour l'alimentation des moustiques. fraction, ainsi que de nombreuses autres espèces moléculaires moins abondantes. La SM MALDI-TOF sur le moustique actif dissuasif pour l'alimentation a été réalisée sur trois lots différents de composés fractionnés. Dans chaque réplique, ces deux masses étaient les ions les plus abondants détectés. Les spectres de ces expériences sont présentés à la fig. S4. Un certain nombre d'autres espèces moléculaires de moindre abondance sont observées dans chaque fractionnement en double des cultures de Xbu (voir fig. S4). Plusieurs de ces composés ne se reproduisent pas dans tous les fractionnements, ce qui les élimine du principe actif. D'autres, notamment à 1430 et 1474, sont observés dans toutes les fractions actives. Cependant, leur enrichissement relatif dans la fraction HPLC active est diminué par rapport à m / z 1302 et 1346. Ceci peut être vu en comparant les intensités du signal pour m / z 1302, 1346, 1430 et 1474 dans la fraction éclair C18 avant et après HPLC (Fig. 3, A et B, et Fig. S4). La diminution de 1430 et 1474 m / z par rapport aux 1302 et 1346 m / z indique seulement une coélution partielle avec l’activité. Parce que nous voulions identifier les composés, nous avons soumis la fraction active dissuasive pour l’alimentation des moustiques à une analyse MS / MS par nanospray sans assistance sur un spectromètre de masse Orbitrap. La nanospray MS a présenté les mêmes espèces moléculaires majeures que celles observées par MALDI-TOF MS, chaque composé étant dans un état de charge dominant de 2, ainsi que d'autres espèces de faible abondance. Des états de charge de 1 à 4 ont été détectés (fig. S5). La MS / MS a été réalisée sur les espèces à double charge à m / z 651,9 et 673,9 en utilisant à la fois la fragmentation par dissociation induite par collision (CID) et la fragmentation par dissociation par collision à haute énergie (HCD). Les spectres MS / MS ont révélé que ces composés étaient structurellement très similaires, avec plusieurs ions communs aux deux composés, et de nombreux ions présentant une différence de 44 Da entre eux, comme précédemment observé par MS MALDI-TOF. Les spectres MS / MS et les assignations d'ions de fragments inférés montrent un excellent accord avec les «fabclavines» récemment décrites, isolées d'une souche similaire de Xbu (11). En utilisant la convention de dénomination décrite dans ces travaux et les structures des fabclavines Ib et IIb, les ions fragments observés étaient compatibles avec l'attribution de m / z 1302 à la fabclavine IIb et de m / z 1346 à la fabclavine Ib (fig. S6, A et B). suggérant que les deux constituants principaux de la fraction active sont des fabclavines.Les résultats des analyses de dégradation d'Edman N-terminales sur le pic actif n ° 3 dissuasif pour l'alimentation des moustiques contenant deux peptides apparentés (fournis dans le tableau S2) n'ont pas permis de déterminer la séquence d'amino acides, probablement expliqués par un N-terminal inaccessible de la molécule en raison de la macrocyclisation (11). Les acides aminés totaux ont été mesurés à partir du pic actif n ° 3 dissuasif pour l'alimentation des moustiques par deux méthodes différentes de chromatographie d'échange de cations forts, systèmes d'élution à base de sodium et de lithium (Molecular Structure Facility, Université de Californie, Davis, Californie, États-Unis). Les deux systèmes ont entraîné des signaux significatifs pour les acides aminés Asx et His (fig. S7, A et B). De plus, deux signaux non identifiés ont été observés, qui pourraient être de l'acide 2,3-diaminobutyrique (les profils d'élution correspondaient à ceux de ce composé). Ensemble, ces données indiquent que deux des acides aminés Asx et His et probablement de l'acide 2,3-diaminobutyrique sont susceptibles d'être présents dans la fraction active dissuasive pour l'alimentation, acides aminés qui sont également décrits dans fabclavines (11). En plus de ceux-ci, contiennent également de la phénylalanine ou de l'histidine et un résidu de proline modifié. Comparaison de l'activité dissuasive des moustiques entre les composés Xbu, le DEET et le picaridinNext, nous avons déterminé la dose de dissuasion des moustiques produite par Xbu avec les moustiques Aedes aegypti. Pour cela, nous avons testé une gamme de concentrations de la fraction active dissuasive et comparé leurs activités d’alimentation à celles du DEET et de la picaridine. Le tableau S1 répertorie les données de dénombrement des moustiques nourris / non nourris utilisées pour estimer la dissuasion alimentaire. Le tableau 1 présente la dose de dissuasion alimentaire (exprimée en mg / cm2) du composé entraînant une réduction de 50 ou 90% de l'alimentation des moustiques. Tableau 1 Détermination de la dose de dissuasion alimentaire (50 et 90%) de DEET, picaridine et Xbu A. aegypti.RE90 est l’efficacité relative de Xbu Peak N ° 3 calculée en proportion de la dose entraînant une réduction de 90% de la consommation de DEET ou de picaridine par les moustiques par rapport à celle de Xbu Peak N ° 3.Une dose entraînant une réduction de 50% L'alimentation parmi la fraction Xbu Peak n ° 3 et le DEET était similaire (Xbu Peak n ° 3 = 0,014 et DEET = 0,012 mg / cm2), alors qu'elle était de 6,14 × inférieure à celle de la picaridine (0,086 mg / cm2). La dose entraînant une réduction de l'alimentation de 90% chez Xbu Peak n ° 3 était bien inférieure à celle du DEET et de la picaridine (Xbu Peak n ° 3 = 0,057, DEET = 0,178 et picaridine = 0,471 mg / cm2), indiquant qu'une concentration beaucoup plus faible La réduction de 90% de la consommation de composés de Xbu est nécessaire par rapport au DEET ou à la picaridine. L'efficacité relative (24) (RE90) du pic Xbu n ° 3, calculée en tant que ratio de la dose entraînant une réduction de 90% de l'alimentation du DEET ou de la picaridine par rapport à celle du Xbu Peak n ° 3, était respectivement de 3,12 et 8,26, ce qui suggère que l'alimentation des moustiques La dose dissuasive de composés Xbu est plus efficace pour empêcher les moustiques de se nourrir au régime cocktail dans les conditions du test de dépistage que le DEET ou la picaridine. Le tableau 2 montre la comparaison analysée par Probit parmi les estimations des moindres carrés (32) pour l’effet de chaque composé. La comparaison des propriétés répulsives basée sur les valeurs de p ajustées entre le DEET et la picaridine était significative (P < 0.05); DEET and Xbu Peak#3 were not significantly different (P > 0,05); et Xbu Peak n ° 3 était significativement différent de la picaridine (p <0,05). Ensemble, l'activité dissuasive des composés bactériens sur l'alimentation est égale ou supérieure à celle du DEET et de la picaridine.Tableau 2 Comparaison de l'activité dissuasive des moustiques pour le DEET, la picaridine et le pic Xbu # 3 contre A. aegypti.Le tableau montre l'analyse effectuée par Probit comparaison entre les estimations des moindres carrés pour l'effet de chaque composé (32). La comparaison dissuasion alimentaire basée sur les valeurs de p ajustées entre le DEET et la picaridine était significative < 0.05); DEET and Xbu Peak#3 were not significant (adjusted P > 0,05); et le pic Xbu n ° 3 était significativement différent de la picaridine (p <0,05 ajusté). Alors que le mécanisme exact par lequel les composés Xbu exercent une dissuasion alimentaire sur les moustiques est un sujet pour de futures investigations approfondies, des observations visuelles au cours de l'alimentation ont indiqué que l'atterrissage et le sondage par Les moustiques Aedes sur le tissu traité avec les composés Xbu étaient dépendants de la dose (film S1). À une dose de dissuasion alimentaire de 50%, la majorité des moustiques ont atterri et environ la moitié ont réussi à se nourrir, alors qu'à une dose supérieure ou égale à 90%, peu de moustiques ont atterri et aucun alimenté. Le film S1 montre le comportement des moustiques en présence d’eau ou de composés de Xbu à 0,057 mg / cm2 (la concentration qui a causé 90% de dissuasion). Les moustiques qui ont atterri ont tenté de sonder le tissu et ont été vus en train de nettoyer leur sonde peu après avoir sondé, mais ils ne se sont pas imbibés de nourriture. Le contact des moustiques avec la surface traitée a donc précédé la dissuasion alimentaire à faible dose. Décrypter la dissuasion alimentaire au moyen de mécanismes olfactifs ou gustatifs contre les composés à faible volatilité, y compris le DEET et la picaridine (33), est difficile en raison du chevauchement des réponses sensorielles (34). L'ajout de DEET au sang (35) a dissuadé les moustiques de se nourrir par contact direct avec le repas de sang, probablement via une réponse gustative. Des sensilles gustatives externes sur les antennes du vecteur de Chagas, Rhodnius prolixus, induisent la dissuasion alimentaire de la quinine ou de la caféine lorsqu’elles sont appliquées sur des solutions d’alimentation couvrant les mailles (36). Certains acides gras ont un effet dissuasif sur l’alimentation chez A. aegypti lorsqu’ils sont appliqués sur des tissus recouvrant le régime artificiel (37). La dissuasion alimentaire manifestée par les composés Xbu pourrait induire une combinaison de réponses olfactive et gustative lors du contact des moustiques avec la surface du tissu traité, de manière dépendante de la dose. Nous avons également observé une dissuasion alimentaire présentée par les composés Xbu avec A. gambiae et C. pipiens . Pour les tests avec ces moustiques, nous avons modifié notre test de dépistage en incorporant une seule couche de mousseline (au lieu de deux couches comme auparavant). Ces moustiques ont eu du mal à se nourrir avec les deux couches de coton décrites pour Aedes. Une couche de mousseline a donné un taux d'alimentation de 75 à 80% (Fig. 2). Les tests d'alimentation effectués avec 0,057 mg / cm2 (la concentration ayant provoqué 90% de dissuasion avec Aedes) pour A. gambiae et C. pipiens sont présentés à la Fig. 2. Les résultats indiquent que les composés Xbu exercent une puissante activité de dissuasion contre A. gambiae et C. pipiens, comme on l'a vu avec Aedes. Les moustiques Aedes ont également été inclus dans cet essai en utilisant la couche unique de tissu.CONCLUSION Les bactéries associées aux nématodes entomopathogènes offrent un potentiel énorme pour de nouvelles bioactivités, dues en particulier aux produits naturels de faible poids moléculaire. Des projets d’exploitation de génomes continuent de révéler des informations sur les grappes de gènes biosynthétiques responsables de la production de plusieurs métabolites secondaires bactériens en attente d’identification et d’attribution de leurs fonctions biologiques naturelles (1). Nous fournissons ici la preuve qu’une activité dissuasive puissante pourrait être concentrée sur l’alimentation des moustiques de cultures Xbu. Les données MS et MS / MS appuient l'identification présumée des fabclavines des deux composés les plus abondants enrichis en fraction active dissuasive, ce qui suggère fortement que l'activité dissuasive est manifestement présentée par ces composés. L'activité dissuasive de l'alimentation, telle que déterminée par les expériences sur l'alimentation des moustiques à membrane, est comparable ou supérieure à celle de l'insectifuge DEET ou de la picaridine contre A. aegypti. En outre, le taux d'alimentation des moustiques Anopheles et Culex a diminué de manière significative en présence de composés de Xbu, ce qui suggère que ces composés sont efficaces pour inhiber un plus large éventail d'espèces de moustiques. Ces résultats suggèrent que les bioactivités de la classe de produits naturels fabclavine pourraient être exploitées dans de nouvelles applications telles que la dissuasion alimentaire des moustiques. Les auteurs reconnaissent que la fraction active dissuasive pour l'alimentation des moustiques est un mélange de composés, dominés par deux espèces moléculaires étroitement liées et copurifiantes à m / z 1302 et 1346. Les études futures devraient (i) explorer la résolution chromatographique ou autre de tous les composés de ces composés. des fractions actives pour identifier les personnes spécifiquement responsables de l'activité dissuasive, (ii) déterminer si les composés peuvent avoir un effet dissuasif individuel sur l'alimentation ou nécessiter une application en mélange, (iii) démontrer l'activité dissuasive des fabclavines via une synthèse de novo ou des expériences d'inactivation, iv ) de déterminer l'efficacité et les propriétés toxicologiques des composés actifs dissuasifs destinés à être utilisés dans les formulations dissuasives / anti-moustiques pour d'éventuels tests sur la peau humaine.MATÉRIAUX ET MÉTHODES Énoncé de la théorieAucun animal vivant ou un sujet humain n'a été utilisé dans les tests de dépistage anti-moustiques de cette étude.Élevage et entretien de moustiques. Colonies de A. aegypti (souche de Liverpool), A. gambiae (G3), une d C. pipiens (souche Iowa) ont été conservés à l’Université du Wisconsin conformément aux procédures standard décrites précédemment (38–41). En bref, les colonies de moustiques ont été maintenues à 26,5 ± 0,5 ° C et à une humidité relative de 80 ± 5%. Les larves ont été nourries avec de la nourriture pour poissons TetraMin. Les moustiques adultes ont été soumis à une exposition constante à 10% de saccharose présent dans des boules de coton. Du sang de lapin défibriné (HemoStat Laboratories, CA, USA) par l'intermédiaire du système d'alimentation à membrane Hemotek (Discovery Workshops, Accrington, Royaume-Uni) décrit ci-dessous a été proposé à la production d'œufs. La membrane de boyau à base de collagène comestible (Nippi Edible Collagen Enveloppe, ViskoTeepak, WI, États-Unis) a été choisie comme membrane de choix pour l’alimentation en sang et le dépistage dissuasif, les trois espèces de moustiques s’y alimentant facilement. Pour les tests de dépistage dissuasifs, 20 moustiques femelles adultes nullipares, accouplées, âgées de 7 à 10 jours, issues du même lot d'œufs, ont été séparées dans des récipients en papier criblés (hauteur × largeur = 8,2 cm × 8,5 cm; Neptune Paper Products, NJ, USA). Les moustiques séparés ont été privés de nourriture pendant 12 à 16 heures avant le test de dépistage. Test de dépistage dissuasif pour moustiquesLes moustiques ont été exposés à des composés dissuasifs pour l'alimentation Xbu ou à des répulsifs test pendant 30 min à température ambiante (lumière incandescente, entre 25 et 26 ° C) entre 10: 00h00 et 16h00 (Heure centrale des États-Unis) en utilisant un appareil d'alimentation à membrane modifié décrit à la Fig. 1. En bref, le contrôleur de température Hemotek a été réglé à une température constante de 37 ° C 5 à 10 min avant le test. Un morceau de 2,5 cm x 2,5 cm d'une membrane d'enveloppe de collagène fraîche, prédécoupée et lavée à fond a été fixé à l'alimentation en métal à l'aide d'un joint torique. Environ 2,5 ml de la ration cocktail contenant du colorant alimentaire rouge à 2% (v / v) (McCormick & Company Inc., MD, USA) ont été introduits à partir de l'ouverture située à l'arrière du distributeur de métal. Un chiffon en coton a été placé sur le corps en collagène et maintenu par des élastiques. Le composé d'essai ou de l'eau a ensuite été appliqué en immergeant l'ensemble d'alimentation dans 1 ml de la solution d'essai respective, puis l'ensemble d'alimentation en métal a été fixé au boîtier de l'alimentation et exposé à des moustiques logés dans un conteneur blindé. Plusieurs types de matériaux de tissu d'épaisseur et de texture / nombre de fils différents ont été évalués dans le but de trouver celui qui permettait un succès optimal de l'alimentation des moustiques. Finalement, un tissu de coton à double couche obtenu auprès de JOANN Fabrics (Madison, WI) a été utilisé avec A. aegypti. Les caractéristiques et les dimensions du tissu de coton choisi étaient les suivantes: nombre de fils = 14,9 × 17,0 fils dans 1 cm2 (moyenne de 10 mesures), diamètre du tissu circulaire appliqué à l’alimentateur en métal = 3,67 cm (voir Fig. 1A), et surface totale de la zone de tissu circulaire exposée aux moustiques = ~ 10,57 cm2. Cependant, pour A. gambiae et C. pipiens, une couche de tissu de mousseline (nombre de fils = 24,3 × 33,9 fils dans 1 cm2; moyenne de 10 mesures) a été utilisée, ce tissu ayant bien fonctionné avec ces moustiques. Les deux types de tissus sont illustrés à la fig. S8.Parce que les composés Xbu ont été dissous dans de l'eau pour les tests, le DEET et la picaridine ont également été préparés dans de l'eau bidistillée filtrée à 0,2 µm. Le DEET a été dilué de SC Johnson’s OFF! Deep Woods contenant 25% de DEET et de picaridine de Clean Insect Repellent (acheté auprès de Walgreens, États-Unis) contenant 7% de picaridine. Des solutions mères à 1% de DEET et de picaridine (équivalant à 10 mg / ml) ont été dissoutes dans de l'eau à partir de laquelle une gamme de dilutions a été préparée pour la détermination de la dose de dissuasion par l'alimentation. Ces deux répulsifs ont été testés à une plage de concentration de 1 à 0,01% (v / v) correspondant à 0,95 à 0,0095 mg / cm2. Les deux composés se sont bien dissous dans l'eau aux concentrations testées. Le DEET et la picaridine ont été testés le même jour avec un intervalle de 4 heures entre les tests. L'échantillon bactérien lyophilisé séparé par HPLC a été dissous dans de l'eau et filtré sur un filtre de 0,2 µm. Pour une évaluation précise, la teneur en protéines de cet échantillon a été déterminée via deux méthodes: (i) dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) conformément aux instructions du fabricant (kit de test de protéines Pierce BCA, Thermo Fisher Scientific, USA) et (ii) acides aminés totaux. analyse (Molecular Structure Facility, Université de Californie, Davis, Californie). La différence de teneur en protéines déterminée par ces deux méthodes était négligeable. Ainsi, pour les mesures de routine, la méthode BCA a été utilisée. Une gamme posologique allant de 0,73 à 0,048 mg / ml (v / v) correspondant à 69,5 à 4,57 µg / cm2 des composés actifs dissuasifs pour l'alimentation des moustiques a été testée avec A. aegypti. Les essais avec A. gambiae et C. pipiens ont été effectués uniquement avec une concentration de composés de Xbu donnant une dose dissuasive de l'alimentation de 90% avec A. aegypti (soit 0,060% (v / v), ce qui correspond à 0,057 mg / cm2; Tableau 1). Trois expériences d'alimentation répétées ont été menées pour chaque composé avec des moustiques éclos de différents lots d'oeufs (pour tenir compte du biais de cohorte) sur une période de 3 semaines. Une réplique consistait en 20 moustiques testés le même jour avec chaque concentration de la plage de dilution. Par exemple, une réplication d'échantillons avec une plage de concentrations allant de 69,5 à 4,57 µg / cm2 a été testée le même jour. Extensive washing of the metal feeders, replenishing of collagen membrane, cotton cloths, and feeding solution for each exposure test and time gaps between assays assured that there was no carryover of the compounds or contamination of the feeders in between assays. As an extra precaution, feeding-deterrence assays with bacterial compounds were purposely performed on a different day than assays with DEET and picaridin. After the completion of the screening assay (30 min), mosquitoes were killed by freezing at −20°C. Fed versus unfed mosquitoes were counted under a dissecting microscope and verified by at least two people. Fed mosquitoes could be easily distinguished as they were engorged and had red abdomens, which were clearly visible even to an unaided eye (fully fed or partially fed), while unfed mosquitos were lean and did not have red abdomens. Mosquitoes that were not engorged and had no red color were considered as unfed and hence deterred (Figs. 1C and 2B). This distinction provided a reliable, quantitative means of assessing the feeding success of mosquitoes with different compounds and across assays and allowed a robust comparison. Count data (proportion of unfed mosquitoes from a total) were used for statistical analysis. Several tests with Xbu Peak#3 from different batches exhibited consistent, concentration-dependent feeding-deterrent activity. Here, results of three replications are presented. Figures 1B and 2A and Tables 1 and 2 present results of all of the feeding-deterrence screening experiments.Isolation, enrichment, and characterization of mosquito feeding-deterrent active compounds produced by XbuXbu bacteria (42) obtained from H. Goodrich-Blair (Department of Bacteriology, University of Wisconsin–Madison, USA) were maintained as glycerol stocks at −80°C. For culturing, the bacteria were freshly streaked onto nutrient bromothymol blue triphenyltetrazolium chloride agar (NBTA) plates (42). A single, isolated blue colony (image of bacteria streaked on LB plate is seen in fig. S9) was taken for further growth in modified minimal medium containing 0.05 M Na2HPO4, 0.05 M KH2PO4, 0.02 M (NH4)2SO4, 0.001 M MgSO4, 0.25% yeast extract, and 0.1 M glucose supplemented with 1% yeast extract. A single bacterial colony was resuspended in 1.5-ml medium from which 200 μl was inoculated in a flask containing 400-ml medium. Bacterial cultures (typically six flasks of 400 ml) were grown at 30°C at 120 rpm in a rotary shaker to stationary phase and harvested at 72 hours after inoculation via centrifugation (3913g, Beckman rotor JA14 at 4°C).The chilled cell-free culture supernatant was mixed with two volumes of ice-cold acetone and incubated cold for 12 to 16 hours while stirring. After precipitation, spent medium/acetone was discarded and precipitates containing the mosquito feeding-deterrent active compounds were dissolved in ultrapure water so as to concentrate these to about 10× of the original culture volume (i.e., 240 ml of water). This solution was first centrifuged at 3578g at 4°C (Beckman rotor JA20) and then filtered through 0.45-μm filter and loaded on a C18 flash reversed-phase column (Reveleris Flash Cartridge, 12 g, BUCHI Corporation, DE, USA) using a peristaltic pump. The column was then connected to a fast protein liquid chromatography (FPLC; Akta Prime Plus, GE Healthcare Bio-Sciences, PA, USA). Solvents for reversed-phase columns were (i) 0.2-μm filtered double-distilled water and (ii) HPLC-grade, 0.2-μm filtered ACN (Fisher Scientific, USA). Both solvents contained 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA).An ACN gradient of 50 to 100% was used to collect the mosquito feeding-deterrent active peak fraction on C18 flash column via FPLC. The elution pattern of the mosquito feeding-deterrent active peak was consistent and reproducible between different batches of cultures/purifications. Representative results of this step are shown in fig. S1. The active fraction from the C18 flash chromatography was filtered through a 5-kDa molecular weight cutoff ultrafiltration device (Sartorius, Fisher Scientific, USA), and the flow through was subjected to further purification using HPLC on an analytical reversed-phase C18 column (Vydac C18 (5 μm, 4.6 mm inside diameter × 150 mm), catalog no. 218TP5415, Fisher Scientific, USA). A gradient of 13 to 40% ACN over 40 min yielded four major peaks detectable at 214 nm, with most of the repellent activity concentrated in Peak#3, which eluted at an ACN concentration of ~24% and a retention time of ~14:00 min. Representative images of HPLC C18 purification are shown in fig. S2, with mosquito feeding-deterrent active Xbu Peak#3 indicated. Other peaks (except peak number 4) had no feeding-deterrent activity (fig. S3). Several HPLC runs were conducted to generate material for feeding-deterrent activity analysis.MS was performed in the Mass Spectrometry Facility at the University of Wisconsin–Madison Biotechnology Center. MALDI-TOF spectra of the active, C18 flash chromatography fraction and the subsequent HPLC-separated active fractions were acquired on a SCIEX 4800 TOF-TOF mass spectrometer (SCIEX, MA, USA). Samples (0.5 μl) were spotted onto a 384-well Opti-TOF insert and 0.5-μl α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (Fluka, Switzerland) at 6 mg/ml in 75% ACN, 0.1% TFA was added, and the sample and matrix were mixed on a plate shaker. The spot was air-dried, and data were acquired in positive ion reflector mode over the m/z range of 700 to 4000 using a laser intensity of 2800 and averaging 1000 shots per spectrum. Mass assignment was performed using external calibration, with calibration taking place immediately before data collection. Electrospray MS and MS/MS were performed using unassisted nanospray by loading the mosquito feeding-deterrent active fraction into pulled, coated borosilicate tips (New Objective, MA, USA) and acquiring positive ion, profile mode spectra on an Orbitrap Elite mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, CA, USA). MS and MS/MS data were collected in the Orbitrap analyzer at a resolving power setting of 120,000. MS data were acquired over the m/z range of 150 to 1800, while HCD MS/MS data were collected from m/z 100 to 1500 and CID MS/MS spectra were collected from m/z 180 to 1500. CID and HCD fragmentations used 35% normalized collision energy.Statistical analysisTo estimate feeding-deterrence dose, we used Probit analysis on the log10-transformed feeding counts data using Statistical Analysis Software, version 9.4 (SAS Institute Inc., NC, USA). The feeding response variable obtained from mosquito counts data followed a binomial rather than a normal distribution. For this kind of nonnormal dataset, a generalized linear model (GLM) is appropriate. The Probit model is one kind of GLM that is used for analyses related to a dose-dependent variable. Data were log10-transformed because of the wide range of concentration values (0.01 to 1) investigated. Feeding-deterrent activity (Tables 1 and 2) was expressed as a dose (in mg/cm2) of the compound (bacterial or DEET or picaridin) applied to cloth that resulted in a 50 or 90% inhibition in mosquito feeding rate similarly as described previously (24). Relative efficacy (RE90) of the deterrent activity was derived by dividing a dose that results in 90% feeding-deterrence of DEET to that of the picaridin and Xbu Peak#3, respectively. Least-squares estimation (32) was conducted to compare differences among feeding-deterrent activity between the three compounds based on adjusted P values (Table 2). P values in Fig. 2 were calculated using Fisher’s exact test using Stata statistical software (Stata Statistical Software: Release 15, StataCorp LLC, College Station, TX).SUPPLEMENTARY MATERIALSSupplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/1/eaau6141/DC1Fig. S1. Enrichment of the mosquito feeding-deterrent active compounds via flash chromatography on reversed-phase C18 column.Fig. S2. Enrichment of the mosquito feeding-deterrent active compounds via HPLC on an analytical reversed-phase C18 column.Fig. S3. Elution profile of feeding-deterrent active fraction. Fig. S4. MALDI-TOF MS analysis of HPLC-enriched feeding-deterrent Peak#3.Fig. S5. Electrospray ionization–Orbitrap MS analysis of the HPLC-enriched deterrent active Xbu Peak#3 showing observed charged states.Fig. S6. MS/MS spectra of doubly-charged molecular species at m/z 651.9 and 673.9.Fig. S7. Amino acid analyses of purified feeding-deterrent fraction.Fig. S8. Appearance of cotton cloths used in the Hemotek-based membrane-feeding assays.Fig. S9. Typical example of Xbu streaked on LBTA (Luria broth agar supplemented with indicator stains bromothymol blue and triphenyltetrazolium chloride) plate.Table S1. Mosquito feeding data used for Probit analysis to generate Tables 1 and 2.Table S2. Results of the N-terminal Edman sequencing trial.Movie S1. Video clip showing feeding response of mosquitoes with water control and at a 90% feeding-deterrence dose of Xbu Peak#3.This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is not for commercial advantage and provided the original work is properly cited.Acknowledgements: We thank H. Goodrich-Blair and A. Torres for sharing the strain of Xbu; Il-H. Kim for discussions on bacterial cultures; L. C. Bartholomay for providing mosquitoes; Bartholomay and R. Weyker for suggestions on collagen casing membrane; E. Norris for suggestions on repellent assays; undergraduates N. Wong, S. Muehlfeld, and M. Dyhr for help with mosquito colony maintenance; W. Goodman and R. Frederick for consultation on compound purification; and Y. Lee, J. Zhu, and C. P. Yadav (NIMR, Delhi, India) for support with statistical analyses. M.K.K. thanks DBT, Government of India, for Ramalingaswami Re-entry Fellowship and for allowing editing of manuscript during final stages, and N. Valecha and R. Dixit (NIMR, Delhi, India) for logistical help. Funding: This work was supported by NIH R21 grant no. AI123719 to S.M.P. Author contributions: S.M.P. conceived the study, provided guidance on study design, and edited the manuscript. M.K.K. designed and performed the experiments, collected and analyzed the data, and wrote the manuscript. G.A.B.-W. collected all MS data and annotated the MS/MS spectra. All authors edited, reviewed, and approved the manuscript. Competing interests: M.K.K. and S.M.P. are inventors on a patent application related to this work filed by the Wisconsin Alumni Research Foundation (no. 62/579,275, filed on 31 October 2017). The authors declare that they have no other competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors. Raw MS data referenced in this publication have been deposited in the MassIVE data repository (https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/massive.jsp) under accession MSV000083089, with digital object identifier doi:10.25345/C5VS3B. These data will be made public and available for download upon publication of this work.Copyright © 2019 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution NonCommercial License 4.0 (CC BY-NC).

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